1878年，美国基督教会在上海嘉定县南翔镇设立悦来书塾，后来分为男女两校，男校名华英学堂，女校名文洁女塾。

1901年，两校迁到湖州马军巷。女校迁来后更名为湖郡女塾。

1906年，在海岛建立中西学堂（原二中校址，现在十二中处），华英学堂随即并入。

1910年，学校改称为海岛中学。

1915年，学校改称为东吴大学第三附属中学，属苏州的东吴大学（苏州大学前身）管辖。

1932年，东吴大学在湖州的第三附属中学与在上海的第二附属中学合并，在湖州建立东吴大学吴兴附属中学。

1938年2月，学校与苏州的第一附中在上海建立东吴大学苏州吴兴临时联合附属中学。

1941年，学校更名为正养中学。

1946年9月，学校恢复东吴大学附属中学名称。

1952年12月，东吴大学吴兴附中与湖郡女子中学正式合并，建立湖州初级中学。

1957年，学校改称湖州第二初级中学。

1958年，学校改称湖州第二中学。

1977年，学校被定为省重点学校。

1997年，学校被评为省一级重点中学。

1998年，学校初中、高中脱离，高中部迁入湖州市学士路新校址。

2025年3月16日，湖州二中膳食监督家长委员会成立。